小麥葉綠體表達載體構建及遺傳轉化.pdf

1、在植物基因工程研究中,質(zhì)體是繼核轉化之后又一新的遺傳轉化和表達受體.質(zhì)體轉化體系具有可同時進行多基因轉化;細菌的基因和很有應用價值的人類的cDNAs可以不經(jīng)過密碼子的修飾或重新合成而直接表達;外源基因表達水平高;后代遺傳穩(wěn)定;定點整合,不會產(chǎn)生基因沉默及母性遺傳,安全性好等優(yōu)點.目前,葉綠體轉化已在煙草、擬南芥菜、馬鈴薯、番茄和油菜(Brassica napus和Lesquerella fendleri)等少數(shù)幾種雙子葉植物中獲得了成功

2、.而單子葉植物,僅在水稻中獲得了轉化植株,但葉綠體基因組沒有達到同質(zhì)化.小麥的葉綠體轉化研究雖然有研究,但未構建定點整合表達載體,僅僅實現(xiàn)了瞬時表達.該實驗通過分析小麥葉綠體基因組全序列(GenBank AccessionNo.AB042240),首次選定了rbcL和psaⅠ基因間隔區(qū)作為外源基因的定點整合位點.用引物1和2擴增包括rbcL基因的3'端部分的約1.0kb的DNA片段,位置從基因組全序列的55744~56767,長度為10

3、42bp,以該DNA片段作為同源重組片段1;用引物3和引物4擴增包括完整的psaⅠ和ycf4這兩個基因在內(nèi)的約1.5kb的DNA片段,位置從基因組全序列的56788~58284,長度為1515 bp,以該DNA片段作為同源重組片段2;以煙草葉綠體基因的啟動子Prrn和終止子psbA3'控制外源基因的轉錄;分別構建了包含gfp報告基因和分別含有篩選標記aadA、nptⅡ和betA基因的小麥葉綠體基因組定點整合表達載體pRAGY,pRNGY

4、和pRCGY.由于葉綠體的原核性質(zhì),所構建的載體首先在大腸桿菌中檢測其有效性.當用這些載體分別轉化大腸桿菌后,通過激光掃描共聚焦顯微鏡和普通熒光顯微鏡均檢測到了構建在表達載體中的gfp基因在大腸桿菌中表達所發(fā)出的強烈的綠色熒光,這表明構建在表達載體中的外源基因在具有原核性質(zhì)的葉綠體中已實現(xiàn)成功表達.用基因槍轟擊法將小麥葉綠體表達載體pRNGY導入小麥核生3號的愈傷組織;轟擊過的材料在MB<,2>繼代培養(yǎng)基上先恢復培養(yǎng)一周,然后轉到添加了