新型篩選標(biāo)記的煙草葉綠體轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建.pdf

1、葉綠體基因組轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記多為抗生素抗性基因，它們雖然高效，但存在不少缺點(diǎn)。四吡咯分子如血紅素、葉綠素和西羅血紅素是植物重要的功能分子，其合成一些關(guān)鍵酶的編碼基因，如編碼谷氨酸半醛轉(zhuǎn)氨酶的基因作為植物轉(zhuǎn)基因的安全標(biāo)記，根據(jù)轉(zhuǎn)基因后代的白化性狀，進(jìn)行高效篩選，而尿卟啉原甲基化酶是一種新型紅色熒光蛋白，但是，在植物中的應(yīng)用還沒有報(bào)道。目前，煙草質(zhì)體轉(zhuǎn)化的技術(shù)最為成熟，本研究主要構(gòu)建煙草葉綠體轉(zhuǎn)化載體，將大腸桿菌編碼谷氨酸半醛轉(zhuǎn)氨酶的基因he

2、mL作為篩選標(biāo)記，玉米編碼尿卟啉原甲基化酶的基因cobA作為熒光報(bào)告基因，利用同源重組片段trnI/trnA構(gòu)建煙草葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 1．采用改進(jìn)的高鹽低pH法提取煙草葉綠體基因組DNA，基因組大小為23kb，OD260：OD280值均在1.8～2.0范圍內(nèi)，提取的葉綠體基因組質(zhì)量很高。
　　 2．根據(jù)NCBI公布的煙草同源重組蛋白trnI/trnA、質(zhì)體核搪體（16S）RNA操縱元啟動(dòng)子

3、Prrn和質(zhì)體psbA基因3’端psbA3’序列，以煙草葉綠體基因組為模板，PCR擴(kuò)增出trnI/trnA、Prrn、psbA3’的特異DNA片段，擴(kuò)增片段測序結(jié)果：trnI基因長度為969 bp，trnA基因長度為883 bp，Prrn基因長度為144 bp，psbA3，基因長度為508 bp，與煙草葉綠體基因組公布的序列進(jìn)行對比分析，同源性較高。
　　 3．根據(jù)公布的hemL和cobA序列，分別以大腸桿菌谷氨酸半醛轉(zhuǎn)氨酶基因

4、GSAT的重組質(zhì)粒和玉米尿卟啉原甲基化酶SUMT的重組質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增出hemL和cobA特異片段。擴(kuò)增片段測序結(jié)果：hemL基因長度為1288bp，cobA基因長度為846 bp。與公布的序列進(jìn)行對比分析，同源性為100％。
　　 4．分別用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶消化相應(yīng)的重組質(zhì)粒，回收外源片段，根據(jù)pBluescript SK+多克隆位點(diǎn)和順序，按差異性位點(diǎn)將外源片斷依次插入到pBluescript SK+中，構(gòu)建了煙草新

5、型葉綠體表達(dá)載體pBSK-TPTCPhemL，序列為：trnI→Prrn→RBS→hemL→RBS→cobA→psbA3’→trnA。用HindⅢ酶切pBSK-TPTCPhemL載體，瓊脂糖凝膠電泳檢測大小為7000 bp左右，說明構(gòu)建的載體大小正確。
　　 綜上所述，本文成功克隆了編碼煙草葉綠體表達(dá)載體的基因片段，并構(gòu)建了煙草表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究這兩個(gè)基因作為葉綠體轉(zhuǎn)化的篩選基因和標(biāo)記基因、建立安全高效的葉綠體轉(zhuǎn)化體系和生物