水稻葉綠體表達載體的構建及遺傳轉化.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、葉綠體轉化技術具有諸多優(yōu)點,但是該技術在水稻上的應用較少。本實驗中,分別克隆了水稻葉綠體表達載體的不同元件,以水稻總DNA為模板,PCR擴增了葉綠體基因組同源重組片段trnI和trnA,與GenBank中水稻葉綠體基因組比對,同源性分別達到99.93％和100％;以載體pEGFP-N2為模板,PCR擴增了具有3種含不同RBS序列的增強型綠色熒光蛋白基因(egfp);煙草葉綠體啟動子Prrn和終止子TpsbA克隆自載體pLM21,與Gen

2、Bank中煙草葉綠體基因組比對,同源性分別達到97.35％和100％。構建了3種能編碼增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的水稻葉綠體轉化載體pIA-EGFP1、pIA-EGFP2和pIA-EGFP3并進行了酶切檢測。將上述所構建載體電轉入大腸桿菌,觀察了大腸桿菌內egfp的表達情況,結果顯示,攜帶的RBS來源于(λ)噬菌體T7gene10的5'UTR的載體pIA-EGFP3熒光最強。以載體pCAMBIA1301為模板,PCR擴增了RBS為T

3、7gene10的5'UTR的潮霉素磷酸轉移酶基因(hpt),并將該片段連入了載體pIA-EGFP3,構建了載體pIA-EGFP3-HPT,將載體電轉入大腸桿菌后檢測了潮霉素抗性,轉化成功的大腸桿菌具有潮霉素抗性。將載體pIA-EGFP3-HPT通過基因槍轟擊洋蔥表皮細胞,觀察egfp的瞬時表達,結果在洋蔥表皮細胞中觀測到了明顯的綠色熒光,說明載體pIA-EGFP3-HPT在洋蔥質體中成功表達,因此認為載體pIA-EGFP3-HPT適合用

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