葡萄根瘤蚜翅型分化相關(guān)基因的克隆及其影響因素研究.pdf

1、葡萄根瘤蚜(Daktulosphaira vitifoliae Fitch)是葡萄上的專性寄生害蟲。2005年我國(guó)再次發(fā)現(xiàn)葡萄根瘤蚜，這對(duì)我國(guó)葡萄產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展構(gòu)成了巨大威脅，而有翅蚜和葉癭型根瘤蚜的產(chǎn)生將會(huì)加速葡萄根瘤蚜的傳播，所以研究葡萄根瘤蚜的翅型分化機(jī)理具有重要意義。本文對(duì)葡萄根瘤蚜翅型分化相關(guān)基因三磷酸腺苷雙磷酸酶Apyrase進(jìn)行了克隆分析，并用熒光定量PCR技術(shù)研究了Appyrase基因在不同齡期有翅、無(wú)翅根瘤蚜中的表達(dá)差

2、異;同時(shí)對(duì)激素和環(huán)境因子對(duì)葡萄根瘤蚜翅型分化的影響進(jìn)行了初步探討。主要結(jié)果如下:
　　1.葡萄根瘤蚜翅型分化相關(guān)基因DvApyrase的克隆、分析
　　利用RT-RACE技術(shù)，首次從葡萄根瘤蚜中克隆得到了葡萄根瘤蚜的翅型分化相關(guān)基因，并對(duì)其全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行了分析。該基因?qū)儆谌姿嵯佘针p磷酸酶超基因家族(Apyrase superfamily)，我們將其命名為DvApyrase，GenBank注冊(cè)號(hào):KJ725377。該基

3、因cDNA序列全長(zhǎng)1199bp，包括一個(gè)1071bp的開放閱讀框、63bp的5'非編碼區(qū)及65bp的3'非編碼區(qū)，其開放閱讀框編碼一個(gè)356aa的多肽，分子量大約為39.68kD。對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在1-20氨基酸之間有典型的疏水區(qū)域，但是不存在典型的跨膜區(qū)，推測(cè)該蛋白是一個(gè)膜外周結(jié)合蛋白。通過(guò)同源性比較發(fā)現(xiàn)，該蛋白的氨基酸序列與其它昆蟲的氨基酸序列同源性在40％-50％之間。進(jìn)化分析表明，葡萄根瘤蚜DvApyrase與來(lái)源于

4、豌豆蚜的SCAN聚類于同一分支，親緣關(guān)系最近。
　　運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)分析了DvApyrase基因在葡萄根瘤蚜有翅、無(wú)翅蚜各齡期的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明:DvApyrase基因在有翅蚜各齡期的表達(dá)量均顯著高于對(duì)應(yīng)無(wú)翅齡期，且在翅型分化的關(guān)鍵齡期（有翅2齡）高表達(dá)，是無(wú)翅2齡的13.62倍，達(dá)到了極顯著水平，之后隨有翅蚜齡期的增長(zhǎng)而逐漸下降。這說(shuō)明DvApyrase基因在葡萄根瘤蚜翅型分化過(guò)程中可能起著關(guān)鍵作用。
　　2.激

5、素對(duì)葡萄根瘤蚜翅型分化的影響分析
　　(1)早熟素PⅡ?qū)Τ嵝头只挠绊?用點(diǎn)滴法處理時(shí)，在1ng/μl-100ng/μl濃度范圍內(nèi)，處理組有翅蚜數(shù)量均顯著高于對(duì)照，且隨著PⅡ濃度的提高，有翅率顯著上升;用飼喂法處理時(shí)，在PⅡ濃度為1ng/μl時(shí)，處理組有翅蚜比率與對(duì)照組相比沒有明顯差異，但當(dāng)濃度增大到100ng/μl時(shí)，有翅蚜比例也顯著提高?？梢?，PⅡ?qū)ζ咸迅鲅恋某嵝头只哂写龠M(jìn)作用。
　　(2)保幼激素JHⅢ對(duì)翅型分化的

6、影響:用點(diǎn)滴法處理時(shí)，在0.1ng/μl-10ng/μl濃度條件下，有翅蚜率顯著低于對(duì)照，但當(dāng)濃度再增加時(shí)，有翅率繼續(xù)減少，但差異不再顯著;用飼喂法處理時(shí)，當(dāng)濃度增大到10ng/μl時(shí)，有翅率也會(huì)顯著下降。可見，JHⅢ對(duì)葡萄根瘤蚜翅型分化具有明顯的抑制作用。
　　3.環(huán)境因子對(duì)葡萄根瘤蚜翅型分化的影響分析
　　以1齡若蟲為材料，就蟲口密度、培養(yǎng)溫度和寄主類型對(duì)其翅型分化的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，葡萄根瘤蚜有翅蚜率隨著蟲口密