構(gòu)建防病、殺蟲(chóng)及具有內(nèi)生定殖能力的多功能工程菌的研究.pdf

1、該研究將含有v ip3A殺蟲(chóng)基因的蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)和具有內(nèi)生及防病等優(yōu)良特性的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)進(jìn)行原生質(zhì)體融合,希望得到具有雙親優(yōu)良特性于一體的工程菌.通過(guò)篩選最終得到一株具有殺蟲(chóng)、防病及內(nèi)生性均較強(qiáng)的多功能融合子.該研究包括以下四部分:一、對(duì)BS-2和WB7菌株進(jìn)行誘導(dǎo)抗性和拮抗作用測(cè)定;二、測(cè)定親本菌株原生質(zhì)體形成和再生的酶解條件;三、在PEG6000和

2、Ca+2存在下進(jìn)行原生質(zhì)體融合及可穩(wěn)定遺傳融合子的篩選;四、穩(wěn)定遺傳融合子的生物學(xué)特性的測(cè)定.通過(guò)傳代實(shí)驗(yàn)檢查發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)后的親本菌株均有穩(wěn)定的抗藥性,同時(shí)誘導(dǎo)后的親本菌株對(duì)黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)的拮抗作用測(cè)定表明:未誘導(dǎo)的親本菌株BS-2及其誘導(dǎo)的抗利福平菌株均具有很強(qiáng)的抗菌能力,誘導(dǎo)后其抗菌作用和菌落形態(tài)沒(méi)有改變;而菌株WB7在誘導(dǎo)前對(duì)黃瓜枯萎病菌有微弱的拮抗作用,誘導(dǎo)的

3、抗卡那霉素菌株則不表現(xiàn)拮抗作用.同時(shí)還將誘導(dǎo)前后BS-2和WB7菌株的拮抗作用進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果顯示它們對(duì)黃瓜枯萎病菌的拮抗作用差異很明顯.原生質(zhì)體最佳制備條件因菌株不同而有很大的區(qū)別,試驗(yàn)結(jié)果表明,親本菌株的原生質(zhì)體形成率隨酶解濃度和酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,但再生率卻下降.綜合以上的情況,為了達(dá)到最佳的酶解和再生率,該實(shí)驗(yàn)將WB7kan和BS-2rif的酶解濃度分別定為0.76mg/ml和1.15mg/ml,在這種酶解條件下WB7kan的原

4、生質(zhì)體形成和再生率分別為95.5％和11.3％,而B(niǎo)S-2rif的為96.77％和10.5％.在PEG6000存在下進(jìn)行親本原生質(zhì)體融合,在雙抗培養(yǎng)基中篩選得到了97株融合子,將它們?cè)陔p抗培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)后,得到了11株可以在雙抗培養(yǎng)基中穩(wěn)定遺傳的融合子,11株融合子對(duì)黃瓜枯萎病菌拮抗作用測(cè)定表明,其中只有6株具有較強(qiáng)拮抗作用的融合子.經(jīng)對(duì)這6株可穩(wěn)定遺傳的融合子對(duì)小菜蛾殺蟲(chóng)活性的測(cè)定和vip3A基因的PCR檢測(cè)后,得到了3株具有殺蟲(chóng)活