基于豬附紅細(xì)胞體α-烯醇化酶基因的LAMP檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、豬附紅細(xì)胞體病(Eperythrozoonosis)是由豬附紅細(xì)胞體（Mycoplasma suis，M.suis）寄生于豬的紅細(xì)胞、血漿、組織液和骨髓中引起的一種多發(fā)性人獸共患傳染病。感染宿主范圍較廣，如豬、牛、山羊、狗、貓等，也包括人類(lèi)。多呈隱性感染使機(jī)體免疫力下降，而導(dǎo)致與其它豬傳染病混合感染或繼發(fā)感染，嚴(yán)重阻礙了我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生的危害較大。
　　采取早期診斷是預(yù)防豬附紅細(xì)胞體病的關(guān)鍵，常規(guī)的診斷方法

2、有涂片鏡檢、ELISA、PCR等，但由于這些診斷方法均需要特殊的儀器和設(shè)備，以及使用者應(yīng)該具備一定的專(zhuān)業(yè)操作技能，而不能在基層養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行推廣應(yīng)用。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification method，LAMP)是Notomi等人建立的一種新型核酸擴(kuò)增方法，可以精準(zhǔn)識(shí)別出靶序列的4-6個(gè)特殊區(qū)域，通過(guò)BstDNA聚合酶在恒定的溫度條件下，快速擴(kuò)增目的基因，經(jīng)電泳形成梯形條帶或SYB

3、R Green I染料染色后直接觀察結(jié)果。LAMP具有反應(yīng)快、效率高、不需要特殊儀器和可直接觀測(cè)結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)，使其成為廣大養(yǎng)殖場(chǎng)自行診斷動(dòng)物傳染病的新型熱門(mén)方法。近幾年，M.suis才被鑒定劃歸為支原體屬（Mycoplasma），其基因組也剛被國(guó)外學(xué)者測(cè)通。α-烯醇化酶基因(α-enolase，eno)是新報(bào)道的具有粘附作用的豬附紅細(xì)胞體表面功能蛋白，常被用于分子生物學(xué)診斷方法的目的基因。
　　因此，本試驗(yàn)依據(jù)GenBank已發(fā)表的

4、M.suis基因組(NC-015153.1)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，擴(kuò)增M.suis的部分α-烯醇化酶基因，經(jīng)TA克隆和測(cè)序，根據(jù)測(cè)序正確的α-烯醇化酶基因，在基因保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)一套LAMP特異性引物，進(jìn)行LAMP預(yù)試驗(yàn)，對(duì)其反應(yīng)溫度、時(shí)間、Mg2+濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化篩選，并進(jìn)行敏感性、特異性、重復(fù)性試驗(yàn)，將建立的LAMP方法用于M.suis的臨床檢測(cè)。結(jié)果表明，本試驗(yàn)成功克隆到M.suis的部分α-烯醇化酶基因，長(zhǎng)度為864bp。建立的LA

5、MP方法的最適反應(yīng)溫度為63℃，Mg2+最適濃度為6mmol/L，內(nèi)外引物最適濃度比為1∶6，可在50 min內(nèi)完成檢測(cè)反應(yīng)，并且通過(guò)SYBR GreenⅠ染料染色后可直接觀察結(jié)果。特異性試驗(yàn)顯示，對(duì)弓形蟲(chóng)、豬鏈球菌Ⅰ型、大腸桿菌和牛源瑟氏泰勒蟲(chóng)的基因組均無(wú)擴(kuò)增，證明該方法具有良好的特異性;敏感性試驗(yàn)顯示，可以檢測(cè)的最低稀釋倍數(shù)為10-6倍，即30 copies/μL，比普通PCR方法的敏感度高100倍，證明該方法具有較高的敏感性;重復(fù)