豬附紅細(xì)胞體OxaA基因膜外區(qū)蛋白的原核表達(dá)及間接ELISA方法的建立.pdf

1、豬附紅細(xì)胞體（Eperythrozoon suis）可以引起豬附紅細(xì)胞體病，它主要存在于豬的紅細(xì)胞表面、血漿以及骨髓內(nèi)，引起主要癥狀有黃疸、發(fā)熱和貧血。
　　對(duì)于豬附紅細(xì)胞體病暫時(shí)沒有較好的手段控制，而且已知的功能性基因偏少。因此，本試驗(yàn)根據(jù)NCBI中公布的豬附紅細(xì)胞體基因組序列，PCR擴(kuò)增獲得包括全基因在內(nèi)1561 bp的吉林株膜蛋白OxaA基因序列，并上傳NCBI（登錄號(hào)：YP_004249851.1）。獲得的OxaA基因序列

2、與豬附紅細(xì)胞體基因組KI_3806（登錄號(hào)：NC_015153）比較，存在21處同義突變，核苷酸序列同源性為98％，氨基酸序列同源性為100%。
　　利用ExPASy、CPHmodels數(shù)據(jù)庫(kù)及TMHMM等方法對(duì)OxaA蛋白的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，OxaA蛋白的理論等電點(diǎn)為9.98，偏堿性；存在多個(gè)信號(hào)肽可能位點(diǎn)和5個(gè)跨膜區(qū)域；二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋、不規(guī)則卷曲為主；三級(jí)結(jié)構(gòu)有明顯的折疊層次； B細(xì)胞抗原表位可能存在于20

3、~24位、28~40位、45~53位、142~150位、260~263位氨基酸處；在9-63和122-176氨基酸區(qū)間存在兩個(gè)膜外區(qū)片段，暫命名為A和B。
　　針對(duì)A和B兩段核苷酸序列分別設(shè)計(jì)引物，連接于原核表達(dá)載體pGEX-4T-1上，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，在大腸桿菌BL-21中表達(dá)。SDS聚丙烯酰胺電泳的結(jié)果顯示兩個(gè)重組蛋白的大小為33.9 kDa和34.6 kDa，而免疫印跡的結(jié)果說明了兩個(gè)重組蛋白均能夠與豬附紅細(xì)胞體陽性血清以及

4、GST單抗發(fā)生反應(yīng)，說明了兩個(gè)重組蛋白的反應(yīng)原性好。其中A蛋白主要以包涵體形式存在，B蛋白為可溶性蛋白。
　　重組蛋白A和B以GST標(biāo)簽樹脂進(jìn)行了純化，并且分別建立了間接ELISA方法，對(duì)兩種方法進(jìn)行了比較。通過對(duì)各條件的篩選，我們確定了重組蛋白B在6.25μg/mL時(shí)為最佳包被濃度，3%的脫脂乳的最佳封閉時(shí)間為37℃1h；待檢血清最佳稀釋度為1:100，最佳作用時(shí)間37℃1h；辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗豬二抗最佳稀釋倍數(shù)為1:50