Mdr1在腫瘤化療中療效及骨髓保護的實驗研究.pdf

1、第一部分多藥耐藥基因1 （MDRl）的克隆及構(gòu)建表達MDRl的重組腺病毒 目的：克隆多藥耐藥基因1(MDR1)至腺病毒質(zhì)粒載體中并導入包裝細胞，產(chǎn)生表達目的基因的重組腺病毒。 方法：PCR法體外克隆出目的基因并將該基因采用定向克隆的方法克隆進入穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV中，采用同源重組方法將該質(zhì)粒和腺病毒質(zhì)粒Adeasy-1連接，最后通過脂質(zhì)體介導的方法導入包裝細胞HEK293中，產(chǎn)生表達目的基因的重組腺病毒。

2、 結(jié)果：(1)PCR法克隆出目的基因MDR1，并通過基因測序篩選出正確的克隆，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pAdTrack-MDR1；(2)將MDR1基因克隆進入腺病毒質(zhì)粒載體中形成重組腺病毒質(zhì)粒Adeasy-MDR1，并將重組腺病毒質(zhì)粒Adeasy-MDR1導入包裝細胞HEK293中形成表達mdr1的高滴度重組腺病毒Ad5-MDR1。(3)收獲的病毒感染液滴度達8.3×10<'11>pfu/ml結(jié)論：克隆出正確的MDR1基因并重組含有目的基因

3、MDR1的腺病毒，收獲高滴度重組腺病毒Ad5-MDR1，為進一步的研究打下了良好的基礎(chǔ)。 第二部分多藥耐藥(mdrl)基因轉(zhuǎn)染C57和Balb/c小鼠骨髓單個核細胞的體外實驗研究 目的：建立一套完整、穩(wěn)定、高效的體外基因轉(zhuǎn)染體系將外源性mdr1基因?qū)隒57和Balb/c小鼠骨髓單個核細胞，評價轉(zhuǎn)染后mdr1基因在靶細胞中功能性表達情況，為進一步將轉(zhuǎn)染的骨髓細胞移植保護受體骨髓免受大劑量化療藥物的損傷實驗提供基礎(chǔ)。

4、 方法：采用乒乓交互感染收集并濃縮病毒上清，采用濃縮病毒上清轉(zhuǎn)染法將mdr1基因?qū)肽[瘤壞死因子α(TNF-α)預處理后的C57和Balb/c小鼠骨髓單個核細胞，采用RT-PCR法、Western-blot分別從基因、蛋白質(zhì)水平檢測mdr1基因在小鼠骨髓單個核細胞中的功能性表達，柔紅霉素排出試驗從功能水平檢測mdr1基因在小鼠骨髓單個核細胞中的功能性表達情況，探討轉(zhuǎn)染時間和轉(zhuǎn)染效率、功能之間的關(guān)系。 結(jié)果：(1)建立了一套完整

5、、穩(wěn)定、高效的mdr1基因體外轉(zhuǎn)染體系；(2)流式細胞儀測得體外轉(zhuǎn)染率可達到26.26％，(3)柔紅霉素排出試驗證實導入的mdr1基因表達產(chǎn)物P-gp有藥物外排泵功能。(4)RT-PCR法證實外源性mdr1基因有效地在小鼠骨髓單個核細胞基因組表達；(5)Western-blot測得轉(zhuǎn)染后P-糖蛋白(P-glycoprotein P-gp)表達較轉(zhuǎn)染前明顯增高； 結(jié)論：通過腺病毒載體可在體外將外源性mdr1基因有效的轉(zhuǎn)入小鼠骨髓單

6、個核細胞中，轉(zhuǎn)染的mdr1基因能有效地在靶細胞基因組中表達，為進一步移植轉(zhuǎn)染細胞保護骨髓免受大劑量化療損傷的體內(nèi)實驗提供基礎(chǔ)。 第三部分mdrl基因轉(zhuǎn)染骨髓移植聯(lián)合超劑量化療治療Lewis肺癌和4T1乳腺癌小鼠的研究 目的：本研究旨在通過mdr1基因轉(zhuǎn)染的骨髓造血細胞移植來提高C57和BNb/c小鼠肺癌和乳腺癌骨髓對化療的耐受性，然后觀察超劑量化療中mdr1基因的骨髓保護及腫瘤治療作用；并監(jiān)測外源性mdr1基因在受體骨髓

7、內(nèi)表達的情況。 方法：將小鼠骨髓單個核細胞與含有人全長mdr1 cDNA的腺病毒共培養(yǎng)4日后，將轉(zhuǎn)染細胞經(jīng)骨髓腔注射移植入經(jīng)<'60>CO放療預處理的Lewis肺癌和4T1乳腺癌荷瘤小鼠體內(nèi)，然后進行超劑量表阿霉素化療實驗，檢測mdr1基因?qū)κ荏w骨髓的保護作用、超劑量化療對腫瘤的治療作用。同時采用RT-PCR法、Western blot法分別從基因、蛋白水平檢測外源性mdr1基因在受體骨髓的表達情況。 結(jié)果：(1)采用培

8、養(yǎng)細胞移植法成功建立Lewis肺癌和4T1乳腺癌動物模型；(2)采用骨髓腔內(nèi)注射移植將轉(zhuǎn)染mdr1基因的骨髓單個核細胞回輸入荷瘤小鼠，受體骨髓中有外源性mdr1基因的功能性表達；(3)超劑量化療實驗中，轉(zhuǎn)染mdr1基因的荷瘤小鼠能耐受3倍劑量表阿霉素的化療，外周血白細胞可維持在正常范圍，同時腫瘤能被有效治療，荷瘤動物的生存時間及生存質(zhì)量明顯高于對照組(P<0.05)，對照組荷瘤動物死于超劑量化療所造成的嚴重骨髓抑制或腫瘤擴散。